Legemlékezetesebb szerepe Samantha Micelli figurája volt az ABC Who's the Boss? sorozatában, amelynek főszereplője Tony Danza volt.

Milano már hét éves korában színésznő akart lenni, miután megnézte az Annie c. Broadway - darabot. Egy évvel később megkezdte színészkarrierjét a "July" c. musicalben, amelyben egy egész évig a főszerepet alakította.

A televíziós debütálása 1984-ben volt Tony Danza lányának szerepében a népszerű Who's the Boss? C. sorozatban, amely 8 évig volt műsoron. Ötéves kihagyás után, 1997-ben Milano visszatért a filmvászonra a rosszcsont Jennifer Mancini szerepében a Spelling forgatta szappanoperában, a Melrose Place-ben. Végigjátszotta az 1998-as évet és a Heather Locklear által játszott szépség, Amanda ellenségét alakította.

Milano szerepelt a To Brave Alaska c. tv-filmben, amelyben egy Alaszkába vetődött pár egyik tagját alakította, aki a túlélésért küzd. Olyan tv-filmekben is játszott, mint a The Surrogate, Candles in the Dark, illetve Amy Fisher szerepében kitűnt a CBS "Long Island Lolita" remake-jében.

A mozivászonon is hamarosan megjelent. Eleinte Alyssa olyan alternatív filmekben szerepelt, mint az Embrace of the Vampire, amelyben leszbikus hölgyet alakított és hármas ágyjelenetekben vett részt, vagy a Poison Ivy II, amelyben még több szexjelenet volt.

Reese Witherspoon barátnőjét játszotta az 1996-os Fear c. thrillerben. A mozinézők emlékezhetnek arra a szerepére, amikor Arnold Schwarzenegger lányát alakította az 1985-ös Commando c. kasszasikerben.

A Melrose Place-ben való debütálásának évében Milano elment a Sundance Film Festival-ra, ahol új filmjének, a Hugo Pool-nak volt a bemutatója. A fesztiválon megkapta a nőknek járó Spirit Award díjat. A Hugo Pool c. filmet Robert Downey Jr. Rendezte, és ő játszotta a főszerepet is, de olyan sztárok is játszottak benne, mint Sean Penn vagy Patrick Dempsey.

Milano jelenleg a három boszorkány egyikét alakítja a WB's Charmed-ban, Shannen Doherty és Holly Marie Combs mellett. A magánéletét illetően, 1999. januárjában férjhezment, de a házassága rövidéletű volt, úgyhogy fiúk készüljetek!!!